斬獲一等獎！杰毅生物宏基因組測序技術(shù)榮獲 2024 華夏醫(yī)學(xué)科技獎！

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近日，2024 年度華夏醫(yī)學(xué)科技獎頒獎大會暨 2024 年院士大講堂在廣州召開，本次大會共評選出 104 個獲獎項目，其中，科學(xué)技術(shù)獎一等獎僅 8 項。由北京大學(xué)人民醫(yī)院王輝教授牽頭，杰毅生物重點參與的 “病原宏基因組測序技術(shù)體系的自主研發(fā)和臨床應(yīng)用” 斬獲一等獎，這也是本次大會的最高獎項之一！

感染性疾病嚴(yán)重威脅人類健康，其防控關(guān)鍵在于早期快速準(zhǔn)確鑒定病原。項目組聚焦病原宏基因組測序技術(shù)體系的產(chǎn)學(xué)研用，取得開創(chuàng)性成果：

（1）自研宏基因組正反向病原富集技術(shù)，實現(xiàn)細(xì)菌、真菌、病毒全覆蓋，提高檢測敏感性；建立標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控體系和評價標(biāo)準(zhǔn)，推動本地化應(yīng)用。

（2）攻克臨床樣本復(fù)雜、提取易污染等瓶頸，自研核酸提取建庫儀和智能病原報告系統(tǒng)，實現(xiàn)全流程自動化、智能化。

（3）挖掘此技術(shù)在藥敏預(yù)測、物種溯源、腫瘤/病原共檢等方向的應(yīng)用潛力，開創(chuàng)了多維應(yīng)用新領(lǐng)域。

華夏醫(yī)學(xué)科技獎是經(jīng)科技部和國家科學(xué)技術(shù)獎勵工作辦公室批準(zhǔn)，由中國醫(yī)促會設(shè)立和主辦的全國性醫(yī)藥衛(wèi)生與健康領(lǐng)域的社會科技獎勵，包括華夏醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)獎、華夏醫(yī)學(xué)衛(wèi)生事業(yè)管理獎等獎項，旨在獎勵領(lǐng)域內(nèi)的科學(xué)技術(shù)成果，鼓勵做出突出貢獻(xiàn)的組織和個人。華夏醫(yī)學(xué)科技獎已成為目前我國醫(yī)藥健康領(lǐng)域最具影響力的獎項之一。

全球首證 | 杰毅生物鸚鵡熱衣原體試劑盒正式獲批上市！

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最新消息，杰毅生物自主研發(fā)的鸚鵡熱衣原體 (Cps) 核酸檢測試劑盒 (PCR-熒光探針法) 通過國家藥監(jiān)局審核正式獲批中國醫(yī)療器械注冊證！注冊證編號: 國械注準(zhǔn) 20243402506。

致病性高，鸚鵡熱感染逐年上升！

鸚鵡熱（psittacosis）又稱 “鳥疫”（ornithosis），是一種由鸚鵡熱衣原體（Chlamydia psittaci， Cps）感染引起的人畜共患疾病。作為自然疫源性疾病，鸚鵡熱主要在各種鳥類或禽類之間傳播，亦可通過呼吸道以空氣或氣溶膠形式感染人類，或通過排泄物感染人類皮膚、黏膜和消化道，導(dǎo)致社區(qū)獲得性肺炎（CAP）。據(jù)統(tǒng)計，Cps 占總體社區(qū)獲得性肺炎（CAP）病例的 1%，在我國重癥 CAP 患者中檢出率約 8.0%。

鸚鵡熱衣原體在全球許多國家、地區(qū)都有發(fā)現(xiàn)，且隨著動物遷徙、寵物鳥類飼養(yǎng)的增加，發(fā)病率也呈逐年上升趨勢。從事鳥類或禽類相關(guān)工作或飼養(yǎng)人員以及鳥類愛好者，接觸鸚鵡熱患者的人群，都是鸚鵡熱感染的高危群體。鸚鵡熱肺炎一年四季均有發(fā)病，秋冬季發(fā)病率升高。秋冬季節(jié)是候鳥遷徙的季節(jié)，候鳥在遷徙期間更容易患病，更易與家禽發(fā)生交叉感染。

“肺炎” 為典型癥狀，易被誤診！嚴(yán)重可危及生命

鸚鵡熱感染者的臨床表現(xiàn)以呼吸系統(tǒng)癥狀為主，典型癥狀包括高熱、畏寒、咳嗽、納差、乏力、頭痛、肌肉酸痛、呼吸困難和肺部浸潤性病變等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征、感染性休克或多器官功能障礙。然而由于鸚鵡熱臨床表現(xiàn)的非特異性，容易造成誤診或漏診，且臨床工作中通常僅在重癥患者中進(jìn)行 Cps 檢測，導(dǎo)致該疾病的診斷率被低估進(jìn)而延誤治療。Cps 感染患者病死率約 1%，但未及時治療的重癥患者病死率可達(dá) 15%~20%。因此，鸚鵡熱患者的早期診斷和針對性治療對于改善疾病預(yù)后、降低重癥患者病死率具有重大意義。

專家共識：首推 PCR 方法進(jìn)行病原學(xué)檢測

《鸚鵡熱診療中國專家共識》提出：
鸚鵡熱的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，當(dāng)患者有發(fā)熱和/或呼吸系統(tǒng)癥狀表現(xiàn)且具有相關(guān)鳥類或禽類接觸史時，應(yīng)重點針對 Cps 進(jìn)行篩查和診斷，提早干預(yù)從而防止 Cps 經(jīng)血播散累及其他器官/系統(tǒng)。
對于疑似鸚鵡熱患者，首先推薦采用核酸檢測方法，如 PCR 進(jìn)行病原學(xué)檢測；當(dāng)不具備核酸檢測條件時，推薦使用血清學(xué)抗體檢測方法進(jìn)行病原學(xué)檢測。

杰毅生物鸚鵡熱衣原體核酸檢測試劑盒

助力鸚鵡熱感染早期精準(zhǔn)診斷

面對鸚鵡熱的流行趨勢及臨床診斷難題，杰毅生物自主研發(fā)推出鸚鵡熱衣原體 (Cps) 核酸檢測試劑盒 (PCR-熒光探針法)，基于熒光定量 PCR 技術(shù)，采用熒光定量 PCR 探針法，針對鸚鵡熱衣原體外膜蛋白的 ompA 基因保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和熒光探針用于鸚鵡熱衣原體核酸的檢測。具備快速、精準(zhǔn)、便捷可及等優(yōu)勢，助力醫(yī)院，疾控等各級醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)對疑似鸚鵡熱感染人群進(jìn)行早期快速篩查，精準(zhǔn)鑒別診斷。

根據(jù)杰毅生物病原大數(shù)據(jù)，以下人群推薦進(jìn)行鸚鵡熱衣原體篩查：

鸚鵡熱推薦篩查高危人群
1）45 歲及以上中老年人；（男性> 女性）
2）鳥類（如鸚鵡）、禽類接觸史；
3）免疫功能低下患者；
4）懷疑社區(qū)獲得性肺炎患者；
5）臨床表現(xiàn)高熱、畏寒、咳嗽、乏力、頭痛及肌肉酸痛等癥狀患者；6）肺部影像表現(xiàn)出浸潤性病變、需要與流行性感冒、傷寒、其他病原體肺炎進(jìn)行鑒別診斷的患者。

媒體專訪 | 感染病原基因檢測有多快？13 小時，還能更快！

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近日，杭州市余杭區(qū)融媒體【蹲點百企換新力】欄目記者對杰毅生物進(jìn)行了專訪，以下為 “看余杭” 新聞報道。

鸚鵡熱，一種曾經(jīng)被定義為罕見病的感染性疾病，這兩年逐漸被大眾熟知，并被廣泛科普。記者來到位于良渚生命科技小鎮(zhèn)的杭州杰毅生物技術(shù)有限公司（以下簡稱 “杰毅生物”）時，檢測人員正在對剛從醫(yī)院取回來的標(biāo)本進(jìn)行檢測。
“杰毅生物” 針對鸚鵡熱全新研發(fā)出來的一款靶向檢測試劑盒，即將在今年年底拿到三類醫(yī)療器械注冊證。對于疑似社區(qū)獲得性肺炎且有禽類接觸史的不明原因發(fā)熱患者來說，用鸚鵡熱試劑盒做一個簡單的檢測，就能夠在 2 小時內(nèi)輕松排查是否存在鸚鵡熱隱患。這一曾經(jīng)在臨床上極難被判斷的感染性疾病，就這樣輕松找到了解決方式。
說它難判斷，原因有二?？陀^上來說，鸚鵡熱的病原體難以在體外成功培養(yǎng)，對于臨床醫(yī)生而言，很難借助培養(yǎng)實驗判斷患者是否感染的是鸚鵡熱；主觀上來說，不少患者很難判斷自己是否有禽類接觸史，鸚鵡熱衣原體可通過空氣或氣溶膠傳播，從實際病例來看，即便只是與鴿子糞共處一室，都有感染風(fēng)險。
研發(fā)強針對性的靶向檢測試劑盒，杰毅生物用到的是熒光定量 PCR 這一核酸檢測金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。但選取哪些病原體作為檢測靶標(biāo)，可不是拍拍腦袋就做決定，而是基于 “杰毅生物” 過去幾年積累的龐大的病原體基因檢測大數(shù)據(jù)。
作為國內(nèi)最早一批接觸高通量測序（NGS）的研究人員，“杰毅生物” 創(chuàng)始人王珺在 2019 年成立企業(yè)時，就將 “讓每位感染患者第一時間得到精準(zhǔn)診療” 作為企業(yè)愿景?！案腥拘约膊∈且活惙浅３Ｒ姷劳雎示痈卟幌碌募膊?，有時從感染到死亡僅僅幾天甚至幾個小時。以往我們的治療非常依賴醫(yī)生的經(jīng)驗，但在面對一些無法進(jìn)行體外培養(yǎng)或培養(yǎng)時間很長、培養(yǎng)成功率很低的病原體時，無論是花費大量的時間去培養(yǎng)還是憑經(jīng)驗使用抗生素，本質(zhì)上都是在拼概率。一般培養(yǎng)病原體需要 3-4 天，醫(yī)生嘗試各種抗生素也需要一定周期來看效果，往往病原體還沒培養(yǎng)出來或是還沒找到合適的抗生素，患者已經(jīng)錯過了最佳治療時機?！?說起曾經(jīng)在臨床見到的一個個鮮活案例，王珺的語氣中充滿了嘆息。
在王珺看來，治療感染性疾病是在與死神搶時間，不能靠猜，更不能等，唯一的解法是，精準(zhǔn)、快速地找到病原體！于是，一套針對病原體高通量測序的 NGS 流水線式自動化全流程解決方案應(yīng)運而生。
“通過這套設(shè)備，從標(biāo)本到報告，僅需 13 個小時就能得出所有核酸結(jié)果，且檢出陽性率達(dá)到 90% 以上。‘杰毅’ 的病原 NGS 檢測在過去幾年已經(jīng)累計做了 40 萬人份，醫(yī)生拿到報告知道患者的感染源是什么，就能立馬切換治療方案，進(jìn)行精準(zhǔn)治療?！?王珺說。
目前，“杰毅生物” 通過自動化、人工智能等技術(shù)極大提高了病原 NGS 檢測時效性，13 小時的速度也已經(jīng)領(lǐng)跑行業(yè)。但在王珺看來，這個速度還不夠快?！癐CU 中有一種膿毒性休克，搶救時效僅有黃金 6 小時。超過 6 小時后，每晚一個小時，死亡率上升 6.6%。” 王珺說，“面對爭分奪秒的感染性疾病，公司成立之初就在不斷精進(jìn)自動化技術(shù)水平，招聘的第一個員工就是做自動化的。經(jīng)過自研技術(shù)的不斷升級和打磨，相信不久的將來，病原 NGS 檢測時間有望實現(xiàn)從 13 小時到 6-7 小時的飛躍。”
當(dāng)然，要實現(xiàn)病原體的快速鑒定，檢測實驗是一部分，精準(zhǔn)識別病原體是另一部分?！敖芤闵铩?擁有包含 35000 余種病原體的龐大數(shù)據(jù)庫，幾乎覆蓋人類目前已知的所有致病的病原體的基因組序列；同時，早在 2019 年企業(yè)就與阿里達(dá)摩院展開合作，用人工智能進(jìn)行快速計算，可以做到幾十 G 的數(shù)據(jù)在測序結(jié)束十分鐘內(nèi)全部完成分析?；诖耍瑱z測完成后生成的測序數(shù)據(jù)才能在極短時間內(nèi)生成病原體檢測報告。
公司多年來持續(xù)投入升級病原 NGS 檢測解決方案，除了幫助感染患者之余，王珺還有更深層的考量：“每一次檢測都會累計一次數(shù)據(jù)，通過一次次分子檢測，病原譜將越來越龐大且精準(zhǔn)。一來，正如我們發(fā)現(xiàn)鸚鵡熱近年來越來越高發(fā)，并非罕見病，基于病原譜，我們可以研發(fā)各種靶向試劑盒；二來，隨著檢測的常態(tài)化，通過數(shù)據(jù)走勢更能預(yù)判流行病可能在什么時候發(fā)生；此外，測序可以精準(zhǔn)了解每一個病原體的基因組序列，以此為基礎(chǔ)可以知道病原體的來源及耐藥信息。我相信這幾點在未來都將對醫(yī)學(xué)發(fā)展帶來很大的幫助?！?/section>

來源|看余杭

查看視頻報道：https://yh.eyh.cn/article/0f73564a-83e2-48f7-906c-dc834c00f7ef.html?timestamp=1733152915416

滿分！杰毅滿分通過 NCCL 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染 mNGS 室間質(zhì)評

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最近，國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心（NCCL）公布了 2023 年全國中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染宏基因組高通量測序室間質(zhì)量評價預(yù)研活動結(jié)果。杰毅生物旗下杭州杰毅醫(yī)學(xué)檢驗實驗室、重慶基拯醫(yī)學(xué)檢驗所 2 家醫(yī)學(xué)檢驗實驗室，以及基于杰毅 Q-mNGS?檢測技術(shù)平臺的多家醫(yī)療機構(gòu)均以滿分成績順利通過本次室間質(zhì)評！

腦脊液 mNGS 已經(jīng)成為 CNS 感染病原學(xué)鑒定的重要實用技術(shù)。本次國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心組織的全國中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染宏基因組高通量測序室間質(zhì)量評價預(yù)研活動，從檢測分析敏感性、特異性等多個方面考核了國內(nèi) mNGS 實驗室檢測常規(guī)腦脊液標(biāo)本中病原微生物的能力。

圖 1. 實驗室成績分布

基于評分方法，本次提交有效結(jié)果的 127 家實驗室所得成績分布如下：100 分的實驗室 45 家，90~99 分（含 90 分的實驗室 60 家，低于 90 分（不含 90 分）的實驗室 22 家。按照≥90 分為合格的標(biāo)準(zhǔn)，合格率為 82.7%（105/127）。

杰毅生物專注病原 NGS 領(lǐng)域，面對中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原多樣，診斷困難等挑戰(zhàn)，自研打造了高效破壁技術(shù)，提升結(jié)核分枝桿菌、真菌等難破壁微生物的檢出率。采用正向廣譜富集顯著提升檢測靈敏度與時效性，PCR-free 建庫等技術(shù)降低背景微生物污染風(fēng)險。基于行業(yè)領(lǐng)先的病原微生物基因數(shù)據(jù)庫，mNGS 檢測覆蓋 35257 種病原體、60 種耐藥基因和 78 種毒力基因，在 13 小時內(nèi)完成相對定量檢測，實現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體精準(zhǔn)鑒別。

依托精準(zhǔn)化、智能化和自動化的 Q-mNGS 宏基因組檢測解決方案和嚴(yán)格的質(zhì)量管理體系，杰毅旗下醫(yī)學(xué)檢驗實驗室在過去 3 年連續(xù)多次以優(yōu)異成績通過全國血液微生物 cfDNA mNGS 室間質(zhì)評、全國下呼吸道感染 mNGS 室間質(zhì)評等國家衛(wèi)生健康委臨檢中心發(fā)起的多項室間質(zhì)評活動，彰顯出高度標(biāo)準(zhǔn)化的 mNGS 檢測能力和穩(wěn)定成熟的實驗室管理水平。在本次 NCCL 室間質(zhì)評的指導(dǎo)下，杰毅將持續(xù)推動更規(guī)范地開展腦脊液 mNGS 并解讀檢測結(jié)果，提升 mNGS 在 CNS 感染中應(yīng)用的精準(zhǔn)性。

會議快訊 | 杰毅 NGS 流水線全流程方案亮相全國病原高通量測序臨床規(guī)范化應(yīng)用培訓(xùn)班

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為保證 NGS 檢測臨床應(yīng)用的有效性，要求實驗室在 NGS 的方法學(xué)建立 (自建檢測)、性能確認(rèn)以及質(zhì)量保證各環(huán)節(jié)中必須規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化，中國醫(yī)學(xué)裝備協(xié)會基因檢測分會于 2024 年 5 月 23~26 日在福建廈門市成功舉辦了 “第二期全國病原體高通量測序臨床規(guī)范化應(yīng)用培訓(xùn)研討班”。

本次培訓(xùn)班采用了培訓(xùn)+研討的模式，中國醫(yī)學(xué)裝備協(xié)會基因檢測分會會長、國家衛(wèi)健委臨檢中心首席專家李金明教授團(tuán)隊，多位全國知名醫(yī)院病原 NGS 應(yīng)用專家以及來自全國各地病原體 NGS 方法建立和質(zhì)量管理負(fù)責(zé)人深度參與了本次高水平、高規(guī)格的學(xué)術(shù)活動。杰毅生物攜 NGS 流水線全流程方案參與本次會議，其中新升級的自動化建庫方案因其 “流水線自動化式” 建庫的設(shè)計理念吸引了多家醫(yī)院檢驗科專家的關(guān)注。

會議期間，我們與全國各地 NGS 檢驗領(lǐng)域的專家老師們進(jìn)行了深度的交流，學(xué)習(xí)并探討 NGS 院內(nèi)應(yīng)用方法學(xué)建立的要領(lǐng)，交流實驗全流程標(biāo)準(zhǔn)化的實踐經(jīng)驗，認(rèn)真聆聽來自病原 NGS 一線用戶的真實需求和期望，從而進(jìn)一步提升產(chǎn)品和交付體系，努力推進(jìn)病原 NGS 應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化的提升。

三度蟬聯(lián)，杰毅生物再登《杭州獨角獸與準(zhǔn)獨角獸企業(yè)》榜單

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2024 年 4 月 24 日下午，由民建中央、中國科協(xié)指導(dǎo)，民建浙江省委會、中國投資發(fā)展促進(jìn)會聯(lián)合辦的第八屆萬物生長大會在杭州舉辦。會上，杭州市創(chuàng)業(yè)投資協(xié)會聯(lián)合微鏈共同發(fā)布了 《2024 杭州獨角獸&準(zhǔn)獨角獸企業(yè)》榜單。杰毅生物自 2022 年起連續(xù)三年榮登杭州準(zhǔn)獨角獸企業(yè)榜單，為杭州這座活力之城持續(xù)注入醫(yī)療健康的創(chuàng)新力量。

據(jù)悉，截至 2024 年 4 月，杭州共有 43 家獨角獸企業(yè)（估值不低于 10 億美元），準(zhǔn)獨角獸企業(yè) 382 家（估值不低于 1 億美元）。其中 “專精特新” 企業(yè)與準(zhǔn)獨角獸和獨角獸企業(yè)群體高度重合，具有高成長性和強創(chuàng)新能力。

杭州杰毅生物技術(shù)有限公司是一家專注于感染性疾病分子診斷的高新技術(shù)企業(yè)。公司聚焦感染疾病精準(zhǔn)診療領(lǐng)域，布局高通量測序（NGS）和基因編輯（CRISPR/Cas）兩大前沿技術(shù)平臺，擁有 100 多項發(fā)明專利等自主知識產(chǎn)權(quán)，搭建起了多層次，高品質(zhì)的產(chǎn)品線及服務(wù)體系。

自成立起，杰毅生物在學(xué)術(shù)科研、產(chǎn)品開發(fā)和應(yīng)用等方面持續(xù)加大投入，深耕分子檢測自動化、數(shù)字化、智能化的創(chuàng)新技術(shù)，構(gòu)建起了新質(zhì)生產(chǎn)力，推出了覆蓋普通感染、中重度感染、急危重癥及復(fù)雜感染等全場景化的創(chuàng)新分子診斷整體解決方案，與全國多家醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)建立起了緊密合作關(guān)系。公司于 2023 年被認(rèn)定為國家級專精特新 “小巨人” 企業(yè)、杭州市余杭區(qū)準(zhǔn)獨角獸企業(yè)，浙江省級高新技術(shù)企業(yè)研發(fā)中心等。
杰毅生物將秉承 “讓每位感染患者第一時間得到精準(zhǔn)診療” 的愿景，堅持價值創(chuàng)新鍛造企業(yè)競爭力，引領(lǐng)醫(yī)療健康行業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。

病原宏基因組高通量測序臨床本地化檢測規(guī)范專家共識

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中國藥師協(xié)會, 中華醫(yī)學(xué)會細(xì)菌感染與耐藥防治分會, 國家衛(wèi)生健康委臨床抗微生物藥物敏感性折點研究和標(biāo)準(zhǔn)制定專家委員會.

DOI:10.3760/cma.j.cn112150-20230720-00019

實驗室自建檢測（laboratory developed test，LDT）是指實驗室自行研發(fā)、確認(rèn)，僅限于本實驗室使用的檢測技術(shù) ［1］。近年來，隨著檢測技術(shù)的創(chuàng)新和發(fā)展，一些前沿技術(shù)如基因測序、質(zhì)譜分析和流式細(xì)胞術(shù)等快速從基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化，并展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。美國已將體外診斷（in vitro diagnostics，IVD）新技術(shù)納入 LDT 模式管理 ［2］。我國 2016 年《國家衛(wèi)生計生委辦公廳關(guān)于臨床檢驗項目管理有關(guān)問題的通知》提出，對于未列入《醫(yī)療機構(gòu)臨床檢驗項目目錄》，但臨床意義明確、特異性和敏感性較好、價格效益合理的臨床檢驗項目，應(yīng)當(dāng)及時論證，滿足臨床需求 ［3］。2021 年國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例》中指出，對國內(nèi)尚無同品種產(chǎn)品上市的體外診斷試劑，符合條件的醫(yī)療機構(gòu)根據(jù)本單位的臨床需要，可以自行研制，在執(zhí)業(yè)醫(yī)師指導(dǎo)下在本單位內(nèi)使用 ［4］。宏基因組高通量測序技術(shù)（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）可以不基于假設(shè)、無偏倚地檢測疑似感染患者標(biāo)本中的病原微生物，擴(kuò)大病原體檢測種類，縮短檢測時間，提供可用于患者診斷、制定治療方案的關(guān)鍵信息，有效提升感染性疾病的診療水平，助力抗菌藥物合理應(yīng)用 ［5］。mNGS 還有助于解決新發(fā)、罕見、疑難病原體的漏檢問題 ［6,7,8,9］。但 mNGS 覆蓋病原體種類多、臨床驗證難度大、驗證周期長，使得常規(guī) IVD 產(chǎn)品注冊較為困難。為滿足臨床需要，本共識將在實驗室符合國家相關(guān)政策法規(guī)以及保證檢測方法性能可靠的前提下如何在本地開展 mNGS 檢測提出具體指導(dǎo)意見。

01 mNGS 實驗室建設(shè)基本要求
Basic requirements for the construction of mNGS laboratory
實驗室結(jié)構(gòu)布局和環(huán)境條件
mNGS 在實驗環(huán)節(jié)中根據(jù)是否使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）構(gòu)建文庫，可分為 PCR 建庫與 PCR-free 建庫兩大類型，兩者在實驗室空間要求上有所差異。PCR 建庫中采用通用引物對文庫核酸分子進(jìn)行擴(kuò)增，核酸產(chǎn)物濃度較高，對產(chǎn)物的后續(xù)操作（加熱、震蕩、離心、混勻、移液）可能產(chǎn)生氣溶膠，易造成實驗室環(huán)境和其他文庫的污染，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。因此，基于 PCR 建庫的 mNGS 實驗室宜參照《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法》［10］ 相關(guān)要求，在符合 PCR 要求的實驗室中開展，防止核酸擴(kuò)增產(chǎn)物造成的實驗室污染。

基于 PCR-free 建庫的 mNGS 實驗可在同一個空間內(nèi)設(shè)置試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)（配備生物安全柜）和建庫測序區(qū)（PCR-free 建庫、文庫純化、等量混合、上機測序）。PCR-free 文庫濃度可能低于 Qubit 熒光定量儀的檢測限，建議使用熒光定量 PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）方法進(jìn)行文庫濃度測定。雖然基于 PCR-free 建庫的 mNGS 實驗在文庫定量前實驗操作不存在 PCR 擴(kuò)增建庫所帶來的氣溶膠風(fēng)險，但仍然需要警惕人員操作等帶來的氣溶膠污染可能性，并在一個相對獨立的空間進(jìn)行 qPCR 法文庫濃度測定。

生物安全防護(hù)
mNGS 所檢測的微生物涉及范圍廣泛，實驗操作應(yīng)該在具備至少生物安全二級（biosafety level 2，BSL-2）資質(zhì)的實驗室中進(jìn)行，并按照生物安全相關(guān)要求進(jìn)行操作。如果處理可疑高致病性病原體的標(biāo)本，須滿足更高要求的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范的要求 ［11］。

設(shè)備設(shè)施
mNGS 實驗設(shè)備和器材應(yīng)能滿足濕實驗、干實驗和質(zhì)量控制需求。由于 mNGS 相較傳統(tǒng) PCR 有更高的病原體覆蓋范圍和防污染要求，在保證實驗質(zhì)量的前提下優(yōu)先采用經(jīng)性能確認(rèn)的封閉式自動化設(shè)備代替部分人工操作，有利于避免實驗過程中來自操作人員和實驗室環(huán)境中的微生物或其核酸造成的污染。

人員配置
根據(jù)每天處理的標(biāo)本數(shù)量，實驗室應(yīng)配備具有相應(yīng)專業(yè)背景并能滿足需要的工作人員，包括：

（1）濕實驗應(yīng)由具備分子生物學(xué)檢驗專業(yè)技能的人員，如分子生物學(xué)檢驗專業(yè)檢驗技師操作；

（2）干實驗需要配備生物信息研發(fā)及管理人員，以保證分析流程、持續(xù)更新、性能確認(rèn)、維護(hù)及管理 ［12］；

（3）結(jié)果審核應(yīng)配備具有臨床感染病學(xué)相關(guān)知識的微生物檢驗醫(yī)師。針對疑難報告，建議成立 mNGS 報告解讀團(tuán)隊，由具備臨床感染病學(xué)、臨床微生物檢驗學(xué)、臨床分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等相關(guān)專業(yè)知識的人員組成。所有人員均須通過崗位相關(guān)的培訓(xùn)和考核，并進(jìn)行定期能力評估方能上崗。

方法學(xué)選擇
實驗室在正式開展實驗前應(yīng)對 mNGS 的全流程檢測方法進(jìn)行選擇和性能確認(rèn)，特別對影響檢測結(jié)果的核心要素，包括但不限于標(biāo)本核酸提取方法、是否去宿主核酸以及去宿主核酸方法、是否富集微生物核酸以及富集方法、建庫方法、測序方法、最小測序數(shù)據(jù)量確認(rèn)、生物信息分析算法、數(shù)據(jù)庫選擇、背景核酸識別方法、新發(fā)病原體識別方法等，以滿足方法符合率、交叉反應(yīng)、精密度、準(zhǔn)確度、檢出限、抗干擾能力（如針對高人源標(biāo)本）、穩(wěn)定性等性能參數(shù)的要求。實驗室要進(jìn)行嚴(yán)格的篩選和充分的數(shù)據(jù)驗證，以求得到最佳的臨床檢測效能。經(jīng)確認(rèn)的檢測方法和實驗參數(shù)需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)文件化管理，并由實驗室的技術(shù)質(zhì)量負(fù)責(zé)人和項目負(fù)責(zé)人共同確認(rèn)后實施。項目負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé) mNGS 項目的立項、研究、驗證、制備等運行管理工作，技術(shù)質(zhì)量負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé) mNGS 項目的研究、質(zhì)量管理體系的建立和運行、產(chǎn)品放行等工作。方法學(xué)參數(shù)如有變更需進(jìn)行驗證后再應(yīng)用于臨床標(biāo)本檢測。

02 濕實驗流程搭建
Construction of wet experiment process
濕實驗流程是指對待測標(biāo)本進(jìn)行前處理、核酸提取、文庫構(gòu)建、高通量測序，以獲得核酸測序數(shù)據(jù)的實驗室操作環(huán)節(jié)。濕實驗流程按操作方式分為手工操作和自動化操作。在引進(jìn)自動化設(shè)備時需要使用與之配套兼容的濕實驗試劑和流程，經(jīng)性能確認(rèn)合格后使用。根據(jù)檢測病原體核酸的類型，實驗室可分別建立脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）濕實驗流程。

標(biāo)本前處理
為提高 mNGS 檢測的敏感性，可考慮在標(biāo)本前處理過程中對病原體或其核酸進(jìn)行富集，可選擇正向富集法與反向富集法兩類。正向富集法以 PCR 富集和探針捕獲為代表，屬于核酸提取后的富集方式。反向富集法即去宿主技術(shù)，包括差速離心、差異化裂解、甲基化抗體處理等流程 ［13］。病原核酸富集需要結(jié)合標(biāo)本類型、項目預(yù)期用途綜合考慮檢測性能、成本、操作時效性以及對目標(biāo)病原體可能造成的損失和偏好性，在開展性能確認(rèn)后再予以使用。

核酸提取
核酸提取分為核酸釋放與純化兩個主要步驟。核酸釋放方法包括物理法（機械研磨、超聲破碎等）、化學(xué)法（十六烷基三乙基溴化銨法或十二烷基磺酸鈉法等）、酶裂解法等，不同方法的核酸釋放效果有差異。實驗室需要綜合考慮不同方法對不同病原體核酸的釋放效果，尋找最佳平衡點保障核酸提取的效率。以物理釋放法為例，破壁強度的提升能提高胞內(nèi)菌和真菌等病原體的裂解效率和核酸得率，但可能會破壞病毒核酸和游離 DNA（cell-free DNA，cfDNA）［14］。在使用物理方法時，破壁時長（循環(huán)次數(shù)）、破壁強度以及微珠材質(zhì)和粒徑都是應(yīng)考慮的因素。為提升釋放效果，可采取物理、化學(xué)、酶解等多方法聯(lián)合使用。在物理破壁完成后，增加十二烷基硫酸鈉和蛋白酶 K 的孵育，可達(dá)到充分裂解、釋放核酸的目的 ［15］。核酸純化一般采用磁珠法或柱法兩種 ［16］，建議對純化后的核酸濃度、純度進(jìn)行測試以滿足后續(xù)建庫的要求。

核酸提取和純化若使用手工操作，應(yīng)考慮不同標(biāo)本類型的差異、不同核酸提取試劑盒的提取效率、純度以及片段大小等因素；若使用自動化核酸提取儀系統(tǒng)，需要綜合考慮檢測通量、自動化程度、成本、核酸質(zhì)量等因素。

文庫構(gòu)建
DNA 文庫構(gòu)建主要分為 TA 連接法建庫與轉(zhuǎn)座酶建庫。RNA 文庫構(gòu)建與 DNA 相比，最主要的差異在于逆轉(zhuǎn)錄步驟，在保證建庫穩(wěn)定性的前提下可考慮去除人核糖體 RNA（占總 RNA 比例約 85%~90%）以提高 RNA 病毒的檢測敏感性。建庫方法可分為手工法建庫和儀器自動化建庫，實驗室在選擇方法前需對核心技術(shù)環(huán)節(jié)（如標(biāo)簽、接頭的連接）質(zhì)量進(jìn)行評估，主要質(zhì)量指標(biāo)包括單/雙標(biāo)簽測序，連接效率等。此外還應(yīng)考察建庫前核酸投入量的下限和上限，確保取得的文庫在核酸插入片段的大小分布上滿足所使用的高通量測序儀、測序模式和讀長，以及后續(xù)生信分析對片段大小的要求（常見要求為插入片段 50~500bp，主峰集中在±100bp），以避免過度片段化或片段化不足的情況。

高通量測序
測序儀與配套試劑、耗材通常為封閉一體化設(shè)計。實驗室按照所選購設(shè)備的操作說明書進(jìn)行相關(guān)操作。在選擇測序儀時，要綜合考慮兼容性、測序通量、測序時間、堿基判定的準(zhǔn)確性、成本等因素。為降低標(biāo)簽跳躍帶來的假陽性，宜使用雙標(biāo)簽測序模式。

03
干實驗流程搭建
Construction of dry experiment process
干實驗流程是指對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析及結(jié)果審核和報告的過程。

搭建模式、數(shù)據(jù)存儲與傳輸
mNGS 生物信息分析涉及算法、軟件和數(shù)據(jù)庫，需要基于臨床預(yù)期用途及可能的日常檢測標(biāo)本量計算所需要的服務(wù)器性能，保證下機數(shù)據(jù)能夠在預(yù)期時間內(nèi)完成分析。如有條件，建議實驗室優(yōu)先使用本地服務(wù)器進(jìn)行數(shù)據(jù)的存儲和管理，數(shù)據(jù)存儲、訪問、下載、分析等均應(yīng)符合國家對醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)管理的要求。若選擇云端分析系統(tǒng) ［17］，由于測序數(shù)據(jù)中含有患者的遺傳信息，需要與服務(wù)提供商針對數(shù)據(jù)訪問、使用、披露、中止、修改的權(quán)限與機密性達(dá)成書面協(xié)議 ［18］。實驗室必須確定數(shù)據(jù)存儲的數(shù)量、媒介、位置和儲存時限，數(shù)據(jù)的傳輸過程中應(yīng)設(shè)置只讀訪問，防止被篡改。

干實驗流程搭建步驟與建議
原始數(shù)據(jù)的存儲與傳輸

實驗室應(yīng)確定原始測序數(shù)據(jù)及 FASTQ 文件在服務(wù)器上存儲的位置，并明確具備唯一標(biāo)識的統(tǒng)一命名，便于數(shù)據(jù)調(diào)用與快速分類查找。文件命名建議包含數(shù)據(jù)檢測/分析日期、檢測實驗室名稱、標(biāo)本類型、測序批次、唯一的標(biāo)本編碼等。命名規(guī)則一旦確定不得隨意改動。

數(shù)據(jù)預(yù)處理

實驗室可通過 FASTQC［19］ 和 MultiQC［20］ 等軟件查看測序數(shù)據(jù)質(zhì)量、總數(shù)據(jù)量、堿基質(zhì)量值（Q20 和 Q30）等，結(jié)合測序芯片泳道上生成的簇密度設(shè)置質(zhì)控點（如簇密度是否偏離有效范圍，堿基識別質(zhì)量值≥Q30 的數(shù)據(jù)比例是否偏低）判斷本批次數(shù)據(jù)能否用于后續(xù)分析。數(shù)據(jù)過濾規(guī)則可根據(jù)實驗室對 mNGS 檢測的敏感性和特異性需求進(jìn)行調(diào)整，建議設(shè)置 Q30 堿基數(shù)量占比>75%、有效序列長度不小于 50bp、含 N 堿基比例小于 10% 等參數(shù)閾值。

過濾宿主序列

為了提高微生物數(shù)據(jù)的分析時效性，需要去除測序數(shù)據(jù)中的宿主序列，通常方法是把比對到人類基因組的序列進(jìn)行過濾。真菌和寄生蟲與人類的基因組序列有一定的同源性，在過濾宿主序列的過程中需要評估運行時間、去除效率與非特異性去除（非人源序列而被錯誤過濾）的序列比例。

物種注釋

物種注釋是病原宏基因組檢測最核心的內(nèi)容之一，主要是將通過質(zhì)量控制的非宿主序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫比對，或者經(jīng)過從頭組裝成 contigs/scaffolds 后再比對到微生物參考數(shù)據(jù)庫，確定在特定序列相似性閾值（如≥97%）下的物種分類級別。物種注釋的準(zhǔn)確性取決于所選注釋工具的敏感性和特異性、算法閾值的合理性、參考數(shù)據(jù)庫的完整性及其納入微生物基因組的準(zhǔn)確性 ［12］。目前可用的注釋工具分為三類：

（1）DNA-to-DNA 比對工具；

（2）DNA-to-Protein 比對工具；

（3）基于特征標(biāo)記基因的比對工具。有研究表明，利用相同的模擬數(shù)據(jù)集測試不同的宏基因組學(xué)分類工具，發(fā)現(xiàn)不同的分類工具識別的物種數(shù)量可能相差 3 個數(shù)量級以上 ［21］。在 mNGS 中，DNA-to-DNA 工具往往比 DNA-to-Protein 工具能夠更好地進(jìn)行物種分類 ［22］，但 DNA-to-Protein 工具在識別新發(fā)和高度可變的基因序列時敏感性更高 ［23］。而在以注重物種豐度的微生物組學(xué)分析中，則推薦使用基于特征標(biāo)記基因的比對工具 ［24］。

總之，實驗室在選擇物種注釋工具時，應(yīng)基于檢測的預(yù)期用途，從運行速度、準(zhǔn)確率、精確率、召回率等維度評估性能 ［17］。實驗室可使用近緣物種的基因序列對分析軟件的物種注釋功能進(jìn)行評估，另外在數(shù)據(jù)庫或分析算法有變更時，以及定期對本實驗室的 mNGS 物種/基因注釋功能進(jìn)行評估。

參考數(shù)據(jù)庫

微生物參考數(shù)據(jù)庫的選擇顯著影響物種注釋分類的結(jié)果 ［25,26］?！逗昊蚪M測序病原微生物檢測生物信息學(xué)分析規(guī)范化管理專家共識》［17］ 中對 mNGS 常用微生物數(shù)據(jù)庫的特征有較為詳細(xì)的描述。目前沒有任何一個公共數(shù)據(jù)庫能夠包含所有的潛在人類病原體的基因組信息（假陰性風(fēng)險），且數(shù)據(jù)庫中不可避免地存在一些注釋錯誤或污染的序列（假陽性風(fēng)險）［27］。因此在構(gòu)建、使用和管理這類數(shù)據(jù)庫時需要重點關(guān)注以下問題：

（1）充分評估數(shù)據(jù)庫的全面性以及納入物種在分類學(xué)上的代表性。同一微生物，往往具有遺傳差異的不同亞型或株，在選擇基因組時，應(yīng)該考慮到微生物的遺傳多樣性，盡可能多地納入不同亞型或株的高質(zhì)量基因組；

（2）無論所選參考基因組的來源如何，實驗室都需要通過重測序或其他技術(shù)手段確認(rèn)其注釋的準(zhǔn)確性，序列的完整性，避免納入錯誤注釋、命名錯誤或代表性不足的微生物序列；

（3）病原體（尤其是 RNA 病毒）在自然狀態(tài)下是不斷發(fā)生變異的，所以需要及時（或定期）對參考數(shù)據(jù)庫中的基因組信息進(jìn)行更新及驗證 ［28,29］，更新的頻率取決于實驗室或臨床的需求，以及序列在公共數(shù)據(jù)庫中的上傳或更新時間 ［28］；發(fā)生可能影響結(jié)果的數(shù)據(jù)庫修改、替換及更新等活動均需要重新進(jìn)行評估；建議實驗室每年對微生物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行審核，必要時隨時進(jìn)行更新。但是對于使用本地化服務(wù)器的實驗室，構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫大小需要權(quán)衡服務(wù)器的計算能力以及報告的時效性要求。

讀長歸一化

mNGS 檢測到的微生物常以讀長數(shù)作為結(jié)果，但它受測序量、標(biāo)本質(zhì)量等因素的影響，并且同張芯片不同文庫分配的下機數(shù)據(jù)量會有波動，所以有必要對讀長進(jìn)行歸一化處理 ［30］。建議將每百萬測序讀長中匹配到某一微生物基因組的特異讀長（reads per million，RPM）作為歸一化指標(biāo) ［30］。如果希望比較不同微生物在同一文庫中的讀長，則還需考慮微生物基因組大小不同帶來的差異（理論上，在相同條件下，基因組越長，測得的讀長越多），建議通過計算每百萬測序量下每一千個堿基的基因組長度的歸一化讀長來消除這種影響 ［28］。需要注意，由于 mNGS 檢測原理不同于 qPCR，RPM 不能作為微生物核酸的定量指標(biāo)。

版本控制

由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)的 mNGS 生物信息學(xué)分析方案，各實驗室自建分析流程內(nèi)部使用的分析軟件與數(shù)據(jù)庫處在不斷更新、確認(rèn)及完善的動態(tài)過程中。為了保證每批次臨床標(biāo)本結(jié)果的可溯源性及可重復(fù)性，實驗室需要明確每一次測試所使用的軟件及數(shù)據(jù)庫的版本，建議在報告單中體現(xiàn)，至少應(yīng)包括分析日期、軟件名稱和版本號、對每個組成工具及算法的用戶自定義參數(shù)和系統(tǒng)默認(rèn)值等 ［28］，可使用版本管理工具如 Conda 完成 ［31］。此外，可使用流程管理工具如 Snakemake 和 Nextflow 等對整個工具集進(jìn)行版本控制。

04
mNGS 的性能確認(rèn)
Performance confirmation of mNGS
干實驗的性能確認(rèn)
當(dāng)生物信息學(xué)分析流程建立后，需對其進(jìn)行性能確認(rèn) ［16］，可以通過三類數(shù)據(jù)集進(jìn)行：

（1）臨床標(biāo)本測序數(shù)據(jù)集：注釋充分、特征明確的臨床標(biāo)本測序數(shù)據(jù)（FASTQ 或其他格式）［32］；

（2）計算機模擬測序數(shù)據(jù)：利用序列模擬軟件模擬生成測序數(shù)據(jù)集 ［16,33］，要求既要具有與真實測序數(shù)據(jù)質(zhì)量相同/相似的技術(shù)參數(shù)（文庫片段長度分布、測序模式、測序錯誤類型及頻率、測序質(zhì)量值、測序深度等）［16,34］，也要盡可能對臨床標(biāo)本的背景成分信息如宿主核酸、微生物和試劑背景核酸等進(jìn)行模擬；

（3）組合數(shù)據(jù)集：利用序列模擬軟件定量模擬一種或多種目標(biāo)病原體的測序數(shù)據(jù)，然后將模擬序列添加到目標(biāo)病原體陰性標(biāo)本的真實測序數(shù)據(jù)中，形成接近臨床標(biāo)本的模擬數(shù)據(jù)集 ［16］。

利用上述數(shù)據(jù)開展性能確認(rèn)，確定干實驗流程的主要性能指標(biāo)，包括準(zhǔn)確率、精確率、召回率和 F1-Score（即精確度和召回率的調(diào)和平均值）等 ［28,35］。如果在比對過程中出現(xiàn)寄生蟲的假陽性結(jié)果（寄生蟲為真核生物，與宿主序列相似度較高，且部分寄生蟲基因組數(shù)據(jù)中存在人源序列的污染），需要考慮設(shè)置更高的陽性匯報閾值或者對相應(yīng)寄生蟲的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行清洗。常見的寄生蟲匯報閾值為與陰性對照相比 RPM 達(dá)到 10 倍以上，基因組數(shù)據(jù)清洗常采用把目標(biāo)寄生蟲基因組單獨與人基因組比對并去除高度同源的序列 ［36］。

全流程的性能確認(rèn)
確認(rèn) mNGS 濕實驗和干實驗全流程對病原體的檢測能力是否能夠達(dá)到臨床預(yù)期用途。在全流程性能確認(rèn)中至少應(yīng)包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、分枝桿菌、絲狀真菌、酵母菌、DNA 病毒、RNA 病毒、寄生蟲，同時應(yīng)關(guān)注胞內(nèi)菌和難破壁的病原微生物。

性能確認(rèn)參數(shù)
可參考《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》［37］、《臨床微生物培養(yǎng)、鑒定和藥敏檢測系統(tǒng)的性能驗證》［38］、《病原宏基因組高通量測序性能確認(rèn)方案》［35］ 等，建議實驗室 mNGS 檢測系統(tǒng)應(yīng)對方法符合率、交叉反應(yīng)、精密度、準(zhǔn)確度、檢出限、抗干擾能力（如針對高人源標(biāo)本）、穩(wěn)定性等性能參數(shù)進(jìn)行確認(rèn)。

樣品盤的制備
樣品盤要包含模擬參考品和已知病原檢測結(jié)果的真實臨床標(biāo)本。樣品盤的設(shè)置應(yīng)嚴(yán)格遵循臨床預(yù)期用途所涉及的標(biāo)本類型，所含微生物應(yīng)有代表性，盡可能覆蓋預(yù)期用途中的病原體。標(biāo)準(zhǔn)微生物菌株可以選用 ATCC 或 CMCC 菌株等。應(yīng)根據(jù)不同標(biāo)本類型來合理地設(shè)置模擬參考品中的人源細(xì)胞濃度（如支氣管肺泡灌洗液的人源細(xì)胞濃度中位數(shù)為 105cells/ml）。模擬參考品中應(yīng)至少包含革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、絲狀真菌、酵母菌、分枝桿菌、DNA 病毒、RNA 病毒、寄生蟲共 8 類病原微生物。在制備模擬參考品前，針對所有待投入微生物進(jìn)行最低檢出限（limit of detection，LoD）研究并確認(rèn)是否能滿足預(yù)期用途中對檢測性能的要求，模擬參考品示例見表 1，D1-1 的微生物投入濃度為 LoD 的 5 倍，可作為弱陽性參考品進(jìn)行準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性等參數(shù)的確認(rèn)，D1-2 的微生物投入濃度為 LoD 濃度，可作為準(zhǔn)確度、精密度、抗干擾能力等參數(shù)的確認(rèn)。

表 1 模擬參考品示例

注：人源細(xì)胞濃度 1×10 5 cells/ml

方法符合率
使用已在國家藥品監(jiān)督管理局備案并批準(zhǔn)上市的商品化實時熒光定量 PCR 試劑盒、數(shù)字 PCR 試劑盒或臨床金標(biāo)準(zhǔn)（微生物培養(yǎng)鑒定、病理染色等）作為參比方法，必要時可使用一代測序作為參比。選取陰性標(biāo)本 5 例，陽性標(biāo)本 5 例。按照標(biāo)本檢測程序與參比方法平行檢測，計算方法符合率。

交叉反應(yīng)
選取同屬內(nèi)近源物種，例如屎腸球菌和糞腸球菌、白念珠菌和熱帶念珠菌、紋帶棒桿菌和白喉棒桿菌等，將其分別按照一定濃度比例進(jìn)行混合測序，統(tǒng)計近源物種的檢出情況、讀長比例、相對豐度比例與預(yù)期是否一致（示例見表 1，D2 參考品）。

精密度
  • 批內(nèi)精密度：將上述參考品在同一時間內(nèi)用相同批次試劑完成 3 個全流程重復(fù)，分析批次內(nèi)結(jié)果重復(fù)性。
  • 批間精密度：用不同批次的試劑分別將上述參考品在 3 個工作日內(nèi)完成各 3 個全流程重復(fù)，分析批次間重復(fù)性。
  • 可接受標(biāo)準(zhǔn)：對陽性標(biāo)本，分析結(jié)果是指通過生信流程得到的檢出病原中包括該參考品中的病原體，則記為正確結(jié)果，否則為錯誤結(jié)果。結(jié)果一致的實驗數(shù)占全部實驗數(shù)比例高于 95%，判斷為可接受。
準(zhǔn)確度
采用參考品（模擬參考品）和真實臨床標(biāo)本進(jìn)行比對。在真實臨床標(biāo)本選擇上，應(yīng)綜合病原體分離培養(yǎng)、患者的影像學(xué)檢查結(jié)果、基于宿主反應(yīng)的檢測結(jié)果以及靶向治療后患者的臨床表現(xiàn)等綜合評價。

  • 樣本選擇：全流程檢測不少于 20 例標(biāo)本，包括 6 例陽性參考品（每例模擬混合參考品包含不少于 4 種微生物），14 例臨床標(biāo)本（不少于 10 例培養(yǎng)陽性）。分析檢測結(jié)果與已知參考品的內(nèi)含微生物以及臨床綜合判斷結(jié)果是否一致，對于結(jié)果不一致的使用 qPCR 或者送至另一穩(wěn)定運行的 mNGS 實驗室進(jìn)行差異檢驗。
  • 可接受標(biāo)準(zhǔn)：20 例標(biāo)本中物種準(zhǔn)確性≥90%，則驗證通過。對于臨床標(biāo)本，金標(biāo)準(zhǔn)方法和結(jié)合臨床信息綜合判定的病原體在 mNGS 檢測結(jié)果列表之中可判定為符合。
檢出限
mNGS 的檢出限受宿主細(xì)胞濃度、核酸提取效率、病原體種類等多種因素影響，建議以待測標(biāo)本類型中宿主細(xì)胞的中位數(shù)濃度對病原體檢出限進(jìn)行評估，以 95% 的重復(fù)均能檢測到某一病原體的最低濃度為檢出限。

  • 濃度選擇：使用陽性參考品梯度稀釋至擬定的檢出限濃度，可重復(fù)測定 5 次或在不同批內(nèi)對該濃度標(biāo)本進(jìn)行 20 次重復(fù)測定（如測定 5d，每天測定 4 份標(biāo)本）?？筛鶕?jù)情況選用稀釋液或陰性標(biāo)本，該稀釋液不得含有被驗證的目標(biāo)病原體。
  • 判斷標(biāo)準(zhǔn)：如果是 5 次重復(fù)檢測，必須全部檢出靶核酸；如果是 20 次檢測，必須檢出至少 19 次（95% 檢出率）靶核酸。
穩(wěn)定性
  • 實驗過程：將投入 5~10 倍 LoD 病原體的臨床模擬標(biāo)本，在 4℃、-20℃冰箱分別保存 1、4、7d，在-80℃冰箱分別凍融 1 和 2 次，評估對檢測結(jié)果的影響。
  • 可接受標(biāo)準(zhǔn)：所有重復(fù)均檢出目標(biāo)病原體。
抗干擾性
在投入 3~5 倍 LoD 病原體的臨床模擬標(biāo)本中分別額外加入更高濃度（比如 106cells/ml、107cells/ml）的宿主細(xì)胞，每份標(biāo)本重復(fù) 2~3 次，以弱陽性參考品無法檢出時的內(nèi)參 RPM 值作為閾值。當(dāng)進(jìn)行臨床報告解讀時，若內(nèi)參 RPM 低于閾值，需警惕假陰性。

05
臨床診斷性能評價
Clinical diagnostic performance evaluation
在完成 mNGS 的分析性能確認(rèn)后，需要使用真實標(biāo)本進(jìn)行臨床檢測效能評估 ［39］。臨床有效性包含敏感性和特異性。敏感性是指參考方法檢測結(jié)果為陽性的標(biāo)本中，mNGS 得到相同陽性結(jié)果的比例 ［40］。敏感性低則意味著會出現(xiàn)較多漏檢（假陰性）。特異性指參考方法檢測結(jié)果為陰性的標(biāo)本中，mNGS 得到相同陰性結(jié)果的比例，特異性低則意味著會出現(xiàn)較多假陽性結(jié)果。參考方法包含微生物培養(yǎng)、病理檢測、免疫學(xué)檢測、PCR、一代測序等。

臨床檢測性能評價主要采用觀察性研究。觀察性研究中通過評價 mNGS 檢測結(jié)果與臨床其他參考方法結(jié)果的一致性，確認(rèn)敏感性和特異性。研究應(yīng)遵循《世界醫(yī)學(xué)大會赫爾辛基宣言》的倫理準(zhǔn)則和國家涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究倫理的相關(guān)要求，應(yīng)當(dāng)經(jīng)倫理委員會審查并同意。標(biāo)本量與預(yù)期用途、評價指標(biāo)等多種因素相關(guān)。標(biāo)本量估算通常是基于統(tǒng)計學(xué)要求的最低標(biāo)本量估計 ［41］。值得注意的是，在評價某些罕見的病原體，陽性病例的數(shù)量有限，可以引用文獻(xiàn)報道的臨床敏感性和特異性作為理論支撐 ［42］。實驗室可采用 “代表性病原體” 進(jìn)行臨床診斷性能評價 ［43,44,45］，比如根據(jù)臨床預(yù)期用途選擇不同類型的常見的病原體 ［43］，以期為同類病原體提供參考和借鑒。近年來已發(fā)表數(shù)篇基于腦脊液、呼吸道標(biāo)本、血漿等標(biāo)本類型的 mNGS 檢測流程和臨床性能確認(rèn)的研究可供實驗方案參考 ［16,25,36,46,47］。

06
mNGS 的質(zhì)量管理
Quality management of mNGS
mNGS 質(zhì)量管理的目的是規(guī)范分析前、分析中和分析后三個階段質(zhì)量控制，確保 mNGS 檢測報告的質(zhì)量。

分析前質(zhì)量控制
分析前質(zhì)量控制涉及標(biāo)本采集和送檢流程，標(biāo)本前處理流程，試劑耗材的批次、分裝、儲存時間以及設(shè)備的維護(hù)等環(huán)節(jié)，需對上述環(huán)節(jié)設(shè)置質(zhì)控點進(jìn)行監(jiān)控?；诖?，應(yīng)建立標(biāo)本采集與送檢流程以明確標(biāo)本選擇、采集時機和方式、容器/耗材、標(biāo)本量、送檢單填寫規(guī)則、運送保存條件、拒收標(biāo)準(zhǔn)等，以減少環(huán)境和人體定植微生物或其核酸污染，同時考慮標(biāo)本保存運輸?shù)姆€(wěn)定性 ［6］；應(yīng)建立臨床標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)化前處理程序，對標(biāo)本性狀（比如澄清、黏稠、帶血、漏液等）和運輸容器/時長/溫度等建立明確的接收和拒收標(biāo)準(zhǔn)；應(yīng)建立試劑、耗材的批次、分裝、儲存時間以及設(shè)備的維護(hù)等流程質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，以保障關(guān)鍵試劑（比如片段化酶、連接酶、聚合酶等）和關(guān)鍵設(shè)備（比如核酸提取儀、PCR 儀、建庫儀、測序儀等）的穩(wěn)定性和有效性。

分析中質(zhì)量控制
分析中質(zhì)量控制涉及核酸提取、文庫建立、測序生信分析等眾多環(huán)節(jié)。涉及的質(zhì)控點包括：核酸濃度、純度、完整性等；建庫前核酸投入量下限與上限、文庫核酸濃度、純度、片段大小分布；文庫有效數(shù)據(jù)量、Q30 值、接頭比例、內(nèi)參序列（人工合成雙鏈 DNA 序列或使用噬菌體，與待測病原體基因組沒有同源性）的檢出等。需要建立：核酸提取的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)；文庫質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)；測序數(shù)據(jù)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) ［48］；明確室內(nèi)質(zhì)控（陰性、陽性質(zhì)控品）的在控和失控標(biāo)準(zhǔn)，每次測序需要包括陰性和陽性質(zhì)控品。質(zhì)控品作為患者標(biāo)本的類似物或替代品，完全按照真實標(biāo)本的檢測流程進(jìn)行操作。不建議用純水或磷酸鹽緩沖液等不含人源細(xì)胞/核酸的標(biāo)本作為陰性對照，因為此類低核酸濃度標(biāo)本會造成建庫失敗或背景微生物序列的過度放大而影響其作為背景監(jiān)測和陽性判斷閾值參考的作用?？梢愿鶕?jù)待測標(biāo)本類型的人源細(xì)胞/核酸濃度的分布和中位數(shù)設(shè)置陰性對照標(biāo)本的人源含量。陽性質(zhì)控品可以根據(jù)分析性能確認(rèn)的數(shù)據(jù)，在人源細(xì)胞基質(zhì)（可與陰性對照標(biāo)本濃度保持一致）中投入 3~5 倍 LoD（弱陽性）的不同類型的滅活微生物來制備 ［16］，不建議使用質(zhì)粒作為陽性質(zhì)控品。

分析后質(zhì)量控制
分析后質(zhì)控涉及報告周轉(zhuǎn)時間、陽性率/陰性率、室內(nèi)質(zhì)控失敗率、報告修改率、與臨床診斷的一致率、復(fù)測率、取消測試數(shù)等數(shù)據(jù)的記錄、統(tǒng)計和分析，對異常記錄提供糾正措施以不斷改進(jìn)和優(yōu)化流程，并審查所有與檢測相關(guān)的文檔 ［49］。此外，各實驗室應(yīng)定期進(jìn)行室間質(zhì)評或能力驗證，在檢測流程有重大調(diào)整，或更換核心試劑耗材時需要再次進(jìn)行性能確認(rèn)。國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心已開展多次 mNGS 室間質(zhì)評預(yù)研，建議實驗室積極參加此類質(zhì)量評價活動，發(fā)現(xiàn)結(jié)果不符應(yīng)立即查找原因，及時整改。

07
mNGS 推薦使用的人群、時機和疾病
Recommended population, timing, and disease for mNGS use
mNGS 推薦使用的人群
重癥感染患者尤其是重要臟器衰竭，甚至多器官功能衰竭患者。常規(guī)檢測的同時，或在常規(guī)檢測未得到病原學(xué)證據(jù)時獲取符合檢測要求的合格標(biāo)本進(jìn)行 mNGS 檢測 ［14,36,50,51,52,53,54,55］；高度疑似復(fù)雜感染，病原學(xué)診斷未明確且常規(guī)抗感染治療無效患者，建議進(jìn)一步完善常規(guī)病原學(xué)檢測的同時開展 mNGS 檢測 ［43,56］；慢性感染，慢性疾病難以除外感染，抗感染療效不佳需要明確病因患者，在完善常規(guī)檢測的基礎(chǔ)上開展 mNGS 檢測 ［57］；免疫缺陷患者感染，因為易發(fā)生機會致病菌感染和混合感染，而且感染病原體復(fù)雜多樣 ［58］，考慮應(yīng)用常規(guī)技術(shù)檢測的同時，或在其基礎(chǔ)上開展 mNGS 檢測；不明原因發(fā)熱患者，考慮感染或不除外感染，規(guī)范性經(jīng)驗抗感染治療無效，考慮應(yīng)用常規(guī)技術(shù)檢測的同時，或在其基礎(chǔ)上開展 mNGS 檢測。

mNGS 推薦使用的時機
  • 盡早使用：危急重癥感染或局部感染不及時處理則后果嚴(yán)重，恐危及生命時，應(yīng)在常規(guī)病原檢測基礎(chǔ)上，盡早使用 mNGS 檢測輔助明確病原體 ［43,59］；特殊病原體感染，存在群體性感染事件風(fēng)險，應(yīng)在開展常規(guī)快速檢測的同時，盡早使用 mNGS 檢測輔助明確病原體。
  • 在治療過程中使用：高度疑似感染性疾病，但傳統(tǒng)微生物檢測反復(fù)陰性且治療效果不佳時，考慮在完善常規(guī)病原學(xué)檢測的同時或在其基礎(chǔ)上開展 mNGS 檢測；傳統(tǒng)病原學(xué)檢測的結(jié)果不能解釋臨床表現(xiàn)的全貌或/和抗感染治療的反應(yīng)，懷疑同時存在其他病原感染時，考慮在進(jìn)一步完善更多病原學(xué)檢測的同時或在其基礎(chǔ)上開展 mNGS 檢測；特殊患者如免疫抑制、器官移植術(shù)后、反復(fù)住院、合并基礎(chǔ)疾病，疑似繼發(fā)感染、新發(fā)感染時，考慮常規(guī)病原學(xué)檢測的同時或在其基礎(chǔ)上開展 mNGS 檢測 ［60,61］。
  • 擇期使用：表現(xiàn)為慢性或局部感染，或慢性疾病不除外感染，在嘗試常規(guī)病原學(xué)檢查未能明確致病源或/和規(guī)范性經(jīng)驗抗感染治療無效時，建議在進(jìn)一步完善常規(guī)病原學(xué)檢測的基礎(chǔ)上，與患者充分溝通后擇期使用 mNGS 檢測輔助明確病原體 ［51］。
08
mNGS 標(biāo)本的選擇及采集
Selection and Collection of mNGS Specimens
mNGS 檢測可對標(biāo)本中所有核酸進(jìn)行檢測，不同標(biāo)本中人源核酸含量不盡相同，人源核酸含量越多，對結(jié)果的干擾越大 ［62］。目前臨床對 mNGS 檢測的要求認(rèn)識不充分，標(biāo)本的選擇、采集和運送缺乏統(tǒng)一的規(guī)范和要求。

mNGS 檢測技術(shù)幾乎適用于所有類型的臨床標(biāo)本，標(biāo)本的選擇須結(jié)合患者情況、流行病學(xué)、病原體特性、受累器官及感染部位等狀況綜合考慮。懷疑高致病性、新發(fā)或突發(fā)傳染病原微生物時，標(biāo)本運送須經(jīng)相關(guān)部門批準(zhǔn)，嚴(yán)格按照《人間傳染的病原微生物目錄》［63］ 的危害程度分類及國際民用航空組織《危險品航空安全運輸技術(shù)細(xì)則》［64］ 的分類包裝及轉(zhuǎn)運要求運輸標(biāo)本，如通過其他交通工具運輸也應(yīng)參照以上述標(biāo)準(zhǔn) ［65］。臨床常見標(biāo)本的選擇見表 2。

表 2 mNGS 檢測的臨床標(biāo)本類型

從無菌部位采集標(biāo)本，應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，避免污染。從有菌部位采集標(biāo)本，應(yīng)采取相應(yīng)防污染措施，避免定植或污染菌對結(jié)果的干擾。標(biāo)本采集后應(yīng)使用無菌、無核酸污染、帶蓋的專用容器，采集后封口膜密封，識別碼標(biāo)記，及時（建議 2h 內(nèi)）送檢。臨床在送檢時盡可能提供詳細(xì)的臨床信息（如患者流行病學(xué)史、感染癥狀體征、疑似感染灶、疑似病原體、影像學(xué)/病理學(xué)證據(jù)等）供實驗室人員綜合參考以便于測序數(shù)據(jù)的正確解讀。標(biāo)本運輸過程中須防污染、防震蕩，使用冷鏈系統(tǒng)轉(zhuǎn)運。

09
報告解讀
Report Interpretation
mNGS 檢出法定傳染病及烈性傳染病病原的處置
傳染病病原名單建議

法定傳染病病原體：包括《傳染病防治法》規(guī)定的各類傳染病病原體。病原體種類應(yīng)根據(jù)國家相關(guān)法律法規(guī)的修正進(jìn)行及時調(diào)整。其他烈性傳染病病原體：建議參考《人間傳染的病原微生物目錄》中對高致病性病原體的相關(guān)定義。

復(fù)核驗證流程

建議根據(jù)國家規(guī)定和驗證需求將標(biāo)本在有資質(zhì)的實驗室內(nèi)進(jìn)行分離培養(yǎng)、特異基因片段檢測、特異性抗原抗體檢測等方法復(fù)核。如沒有剩余標(biāo)本，應(yīng)在做好生物安全防護(hù)的情況下進(jìn)行臨床重新采樣，應(yīng)用傳染病診斷標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的實驗室診斷技術(shù)進(jìn)行病原檢測，基于病原檢測結(jié)果，結(jié)合臨床癥狀、流行病學(xué)史，依據(jù)現(xiàn)行傳染病診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。

傳染病病原體處置建議

如患者被診斷為傳染病的，按照《傳染病防治法》等法律法規(guī)規(guī)定的流程上報疾控部門，并且對患者、標(biāo)本等進(jìn)行規(guī)范的處置。應(yīng)按要求將剩余標(biāo)本或重新采集標(biāo)本送上級部門進(jìn)行確認(rèn)，并上報患者情況，同時做好必要的患者隔離措施和相關(guān)治療工作。

疑似新發(fā)病原體處置建議

若檢出疑似新發(fā)病原體，應(yīng)立即組織專家開展研判，尤其當(dāng)疑似新病原體的序列與已知的烈性或者高傳染性病原體序列相似，或者短時間內(nèi)從≥2 例流行病學(xué)相關(guān)患者中檢出疑似新病原體時，應(yīng)立即上報有關(guān)部門。

報告解讀的邏輯
病原體物種解讀

檢出法定傳染病及烈性傳染病病原，尤其是當(dāng)檢出甲類傳染?。ㄊ笠摺⒒魜y）以及部分傳染性較強、危害較大的乙類傳染病（如傳染性非典型肺炎、脊髓灰質(zhì)炎、人類高致病性禽流感、炭疽等）病原體，應(yīng)立即對下機數(shù)據(jù)的質(zhì)量，特別是比對到烈性傳染病的特異性序列的準(zhǔn)確性、讀長數(shù)、基因組覆蓋度等數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格核實，確認(rèn)可排除背景核酸污染以及特異性序列比對無誤的前提下，同時啟動標(biāo)本復(fù)核程序。當(dāng)從標(biāo)本中檢出明確可導(dǎo)致感染且能排除污染、定植微生物和背景核酸時，應(yīng)報告高度懷疑該病原菌為引起感染的病原菌?；颊邿o菌部位標(biāo)本如血液和腦脊液標(biāo)本中檢出可疑病原菌，在無其他感染病原證據(jù)且能排除污染、定植微生物和背景核酸時，應(yīng)報告為可疑致病微生物。從開放性腔道如呼吸道或可能存在皮膚定植菌污染部位的標(biāo)本中檢出條件致病微生物時應(yīng)結(jié)合序列數(shù)、文庫濃度、患者臨床病史信息、感染相關(guān)指標(biāo)，會同多學(xué)科專家進(jìn)行討論明確是否為責(zé)任病原體。報告單中應(yīng)至少包含檢出的病原微生物種屬名稱、唯一比對的讀長數(shù)、相對豐度和室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)，以及對術(shù)語、技術(shù)參數(shù)和病原微生物的注釋。mNGS 報告中的病原體物種名稱應(yīng)標(biāo)注標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱，部分可參考的網(wǎng)站包括細(xì)菌網(wǎng)站 https：//lpsn.dsmz.de/和真菌網(wǎng)站 https：//www.mycobank.org 等。

耐藥/毒力基因解讀

通過耐藥/毒力基因預(yù)測病原菌對抗菌藥物的敏感性以及病原體的致病力，可為臨床的抗感染治療提供參考依據(jù)。但需要注意的是，不是所有的耐藥/毒力基因存在即表達(dá)，可能存在基因型和表型不一致的情況；部分導(dǎo)致耐藥/致病的機制尚無法通過檢測基因來明確；目前對于耐藥/毒力基因的物種歸屬分析技術(shù)尚未完善。因此，應(yīng)謹(jǐn)慎開展以耐藥/毒力基因來預(yù)測病原微生物耐藥性和致病力。對于實驗室可開展常規(guī)藥敏試驗檢測病原菌對抗菌藥物敏感性結(jié)果的藥物，不宜以耐藥基因結(jié)果進(jìn)行預(yù)測，應(yīng)以表型法藥敏試驗結(jié)果為準(zhǔn)。

10
LDT 項目備案與管理
LDT project filing and management
目前，mNGS 的國內(nèi) LDT 模式還未形成系統(tǒng)性的管理規(guī)范，在具體的檢測技術(shù)層面上存在標(biāo)準(zhǔn)化程度低、檢測結(jié)果差異大、質(zhì)量控制體系不完善等問題。2021 年 6 月發(fā)布的《醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例》第五十三條為 LDT 模式的合規(guī)化開展提供了法理依據(jù)，在實操層面，國家重點支持推進(jìn) LDT，2023 年 1 月國家藥監(jiān)管理部門及衛(wèi)生主管部門聯(lián)合印發(fā)關(guān)于 LDT 試點工作的通知，對于自行研制使用體外診斷試劑的試點醫(yī)院資質(zhì)、試劑制備要求、質(zhì)量管理等重點方面作出了相應(yīng)的監(jiān)管要求，建議符合條件開展 LDT 項目的醫(yī)療機構(gòu)，密切關(guān)注立法及監(jiān)管最新動態(tài)，按相關(guān)法規(guī)進(jìn)行申報、備案和管理。

執(zhí)筆人：

楊啟文（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科）；馬筱玲（中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科）；張建中（中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所）；李軼（河南省人民醫(yī)院檢驗科）；吳文娟（上海市東方醫(yī)院檢驗科）；楊繼勇（解放軍總醫(yī)院檢驗科）；韓東升（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗科）；李家斌（安徽醫(yī)科大第一附屬醫(yī)院感染科）；羅燕萍（解放軍總醫(yī)院檢驗科）；周華（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸科）；谷麗（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院感染科）；張西京（空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科）；李敏（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗科）；單斌（昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科）；胡付品（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所）；劉正?。ㄖ袊t(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院感染科）；周海?。ㄖ袊膊☆A(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所）

主要審稿專家（按姓氏首字母順序排列）：

陳德昌（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科）；馮四洲（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液科）；顧兵（廣東省人民醫(yī)院檢驗科）；胡繼紅（國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心）；劉曉琳（國家衛(wèi)生健康委員會合理用藥專家委員會）；孫自鏞（華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗科）；施毅（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院呼吸科）；王明貴（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所）；王佳偉（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）；徐英春（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科）；肖永紅（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院感染科）；俞云松（浙江省人民醫(yī)院感染科）；張耀華（中國藥師協(xié)會）；鄭磊（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗科）；鄭波（北京大學(xué)第一醫(yī)院感染科）；卓超（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科）；周鐵麗（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科）

參考文獻(xiàn)：略